Các nhà di truyền học tế bào đã bước vào kỷ nguyên sinh học phân tử cùng với việc khởi động với các kỹ thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization), chúng cho phép các nhà khoa học xác định được vị trí của các trình tự DNA đặc biệt trên nhiễm sắc thể. Bắt đầu từ thí nghiệm lai tại chỗ đầu tiên năm 1969 (Gall & Pardue), rất nhiều biến thể của quy trình này đã được phát triển, nâng cao độ nhạy của kỹ thuật. Ngày nay, kỹ thuật lai tại chỗ phổ biến nhất sử dụng các đầu dò huỳnh quang để phát hiện các trình tự DNA, và quy trình thực hiện được gọi dưới cái tên Lai huỳnh quang tại chỗ- FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Các biến thể của kỹ thuật FISH được các nhà di truyền học tế bào sử dụng để phát hiện các bất thường về nhiễm sắc thể của bệnh nhân.
Ứng dụng trong việc định vị trình tự DNA trên nhiễm sắc thể
Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã mô tả thành công chuỗi DNA của các sinh vật dựa trên hệ thống các liên kết hydro giữa hai mạch của một sợi xoắn kép. Ngày nay, thậm chí một đứa trẻ cũng biết adenine sẽ liên kết với thymine trên mạch DNA, và cytosine sẽ liên kết với guanine. Do có rất nhiều các liên kết hydro giữa các base này, nên chuỗi xoắn kép có một cấu trúc xác định và bền vững. Hơn nữa, nếu các liên kết hydro này bị phá vỡ dưới tác động của nhiệt hay hóa chất, chuỗi xoắn có thể sẽ tái cấu trúc lại. Khả năng tái cấu trúc này của sợi kép DNA là cơ sở nền tảng cho các phép lai phân tử.
Trong các phép lai phân tử, trình tự “nhãn” DNA hay RNA được sử dụng như một đầu do để phát hiện và định lượng các trình tự bổ sung có trong mẫu sinh phẩm. Trong những năm 1960, Joseph Gall và Mary Lou Pardue nhận thấy phép lai phân tử có thể được sử dụng để xác định vị trí các trình tự DNA trên nhiễm sắc thể. Thực tế, năm 1969, hai nhà khoa học đã công bố một công trình chứng minh các bản sao đã gắn phóng xạ của DNA ribosome có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự DNA bổ sung trong nhân trên đối tượng nghiên cứu là trứng ếch. Do có thể quan sát được trình tự ở trạng thái nguyên bản, rất nhiều các cải tiến đã được đưa ra để tăng độ linh hoạt cũng như độ nhạy của phép lai. Đến những năm gần đây, phép lai tại chỗ được coi là một công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu di truyền học tế bào.
Đầu dò huỳnh quang
Ngay sau công trình của Gall và Pardue, các nhãn huỳnh quang nhanh chóng thế chân các nhãn phóng xạ do chúng an toàn hơn, có độ ổn định cao và dễ phát hiện (Rudkin & Stollar,1977). Trên thực tế, đa số các kỹ thuật lai tại chỗ hiện nay đều sử dụng quy trình lai FISH. Việc phát hiện trình tự DNA đích được ví như tìm kim đáy bể, hay nói cách khác một “cây kim” DNA được vùi trong “một bể” nhiễm sắc thể. Việc nghiên cứu sẽ trở nên dễ dàng hơn nữa nếu nghiên cứu viên sử dụng các “nam châm” mạnh- trong trường hợp này, quá trình lai sẽ xảy ra khi “nam châm” gặp “cây kim” DNA, việc này cần có sự trợ giúp của đầu dò và trình tự đích (Hình 1). Trong hình, trình tự đầu dò, thường là một đoạn DNA nhân dòng, có màu đỏ, đoạn DNA đích có màu xanh. Liên kết hydro nối hai sợi của chuỗi xoắn DNA được biểu diễn bằng các đường màu đen.
Bước đầu tiên của quá trình là khiến cả bảo sao gắn huỳnh quang của trình tự dò và bản sao biến thể của trình tự dò có thể phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó, trước khi lai, cả trình tự đích và đoạn dò phải được biến tính bằng nhiệt hay hóa chất. Bước biến tính này giúp bẻ gãy các liên kết hydro cũ và hình thành các liên kết hydro mới giữa trình tự đích và đầu dò ở giai đoạn lai. Trình tự đích và đầu dò được trộn với nhau, đầu dò sẽ bổ sung đặc hiệu với một trình tự nhất định trong “bể” nhiễm sắc thể. Nếu đầu dò thực sự có thể phát huỳnh quang thì nó sẽ được phát hiện ở vị trí lai. Ngoài ra, để có thể quan sát được sản phẩm lai hình thành từ đầu dò và tình tự đích, người sử dụng cần có các kính hiển vi huỳnh quang để quan sát.
Khi thiết kế thí nghiệm lai FISH, người sử dụng cần cân nhắc về độ nhạy và độ phân giải cần thiết cho thí nghiệm để lựa chọn các thiết bị phù hợp. Độ nhạy phụ thuộc rất nhiều vào khả năng tụ sáng của các kính hiển vi đặc biệt, độ nhạy càng cao thì càng có khả năng phát hiện được các trình tự đích có kích thước nhỏ. Độ phân giải tương đương với khả năng phân biệt hai điểm trên chiều dài nhiễm sắc thể. Các kính hiển vi quang học bình thường không thể cho độ phân giải nhỏ hơn 200-250 nm, đây là giới hạn quan sát của phổ ánh sáng nhìn thấy. Ngoài ra, nghiên cứu viên còn cần cân nhắc lựa chọn thời điểm lai, nhiễm sắc thể ở kỳ giữa có kích thước lớn gấp hàng ngàn lần nhiễm sắc thể ở kỳ trung gian, như vậy, chỉ cần một thấu kính có độ phóng đại x10 là có thể quan sát được DNA bằng mắt thường.
Sử dụng lai FISH để phát hiện vị trí của gen
Phép lai FISH là một công cụ đắc lực để xác định vị trí của trình tự DNA nhân dòng trên nhiễm sắc thể ở kỳ giữa. Hình 2a là kết quả của phép FISH tối ưu. Băng đỏ là vị trí lai của hai nhiễm sắc thể tương đồng. Các thí nghiệm cho thấy mỗi băng đỏ thực tế bao gồm hai điểm, tương ứng với hai nhiễm sắc tử chị em trong nhiễm sắc thể nguyên phân. Các kỹ thuật viên có kinh nghiệm có thể sử dụng dữ liệu từ phép lai cũng như từ vị trí trình tự dò để biết được các gen có trên nhiễm sắc thể.
Về mặt lịch sử, FISH và các phép lai tại chỗ khác là công cụ đem đến sự thành công trong dự án lập bản đồ gen người. Kết quả từ các thí nghiệm sẽ được liên kết và lưu lại trong một cơ sở dữ liệu, và các thông tin này sẽ được sử dụng khi phân tích trình tự gen. Ngày nay, khi dự án giải trình tự gen người đã hoàn thành, các nhà khoa học ít khi sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ chỉ để xác định vị trí gen trên nhiễm sắc thể, thay vào đó, hiện nay kỹ thuật lai FISH đang được sử dụng trực tiếp trong công tác chẩn đoán lâm sàng tại các bệnh viện.
Chẩn đoán các bất thường trên nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật lai FISH và kỹ thuật lập Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype)
FISH và các kỹ thuật lai tại chỗ khác là một bước quan trọng trong quy trình chẩn đoán các bất thường trên nhiễm sắc thể, bao gồm các đột biến mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn. Hình 2b cho chúng ta thấy một ví dụ về việc sự kết hợp giữa hai kỹ thuật lai FISH và lập Nhiễm sắc thể đồ để phân tích đột biến chuyển đoạn ở bệnh nhân. Các đầu do tương ứng với gen trên nhiễm sắc thể 19, được dự đoán là chứa các điểm đứt chuyển đoạn. Ba vùng lai xuất hiện trên ảnh huỳnh quang, một ô tương ứng với bản sao bình thường của nhiễm sắc thể 19 (nl19), hai ô khác tương ứng với các biến đổi của nhiễm sắc thể 11 và 19 do đột biến chuyển đoạn gây ra. Do đó, kỹ thuật viên có thể sử dụng dữ liệu từ điểm đứt trên nhiễm sắc thể 19 để xác định các nhiễm sắc thể thứ cấp do đột biến sinh ra.
Sử dụng kỹ thuật lai FISH để phân tích nhiễm sắc thể ở kỳ trung gian
Nhờ sự trợ giúp của kỹ thuật lai FISH, các nhà di truyền học tế bào có thể phân tích nhiễm sắc thể ngay ở kỳ trung gian cũng như ở kỳ giữa. Đây là một tiến bộ về mặt kỹ thuật, kỹ thuật viên không cần phải nuôi cấy tế bào trong nhiều ngày, thậm chí nhiều tuần trước khi nhiễm sắc thể có thể được phân tích. Hơn nữa, phép lai FISH có thể được sử dụng để phân tích nhiễm sắc thể từ mẫu bệnh phẩm như mẫu mô u rắn. Một đặc điểm hữu ích nữa của kỹ thuật này là các nhà khoa học hoàn toàn có thể điều khiển cùng lúc nhiều vị trí gắn khác nhau nếu các đầu dò được gắn các nhãn huỳnh quang khác nhau.
Hình 3 là một ví dụ về việc sử dụng kỹ thuật lai FISH trong phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể. Hình cho thấy nhân ở kỳ trung gian của một bệnh nhân mắc bệnh Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1A. Bệnh này do đột biến lặp đoạn trên nhiễm sắc thể 17 gây ra, gen bị đột biến mã hóa cho một protein có trong bao myelin bao quanh sợi thần kinh. Tế bào của bệnh nhân được lai với đầu dò nhãn đỏ tương ứng với một trình tự có vùng lặp, cùng với một đầu dò xanh tương ứng với một trình tự trên nhiễm sắc thể 17 nằm ngoài vùng lặp. Từ hai tín hiệu xanh, ta có thể quan sát thấy hai bản sao của nhiễm sắc thể 17 có trong nhân. Một bản là trạng thái thường, trong khi bản thứ 2, der(17), chứa vùng lặp.
Một ứng dụng khác của kỹ thuật lai FISH ở kỳ trung gian là nhuộm, hay tô màu các nhiễm sắc thể đặc biệt để thu các thông tin về sự tổ chức nhiễm sắc thể trong nhân. Hình 2a cho chúng ta thấy hình ảnh nhân ở kỳ trung gian được nhuộm với các chất nhuộm nhiễm sắc thể đặc biệt. Bằng cách phối hợp các đầu dò nhiễm sắc thể đặc biệt với các kháng thể, các nhà khoa học có thể sử dụng kỹ thuật lai FISH để cung cấp một cái nhìn mới về “kiến trúc nhân”.
Các ứng dụng khác của phép lai FISH trong xét nghiệm lâm sàng và nghiên cứu
Các ứng dụng mới của kỹ thuật lai FISH sẽ tiếp tục được phát triển. Ví dụ, các nhà di truyền học tế bào ngày nay có thể sử dụng phép lai ghép gen so sánh (CGH- comparative genomic hybridization) để phát hiện sự sai khác về số lượng, hay sự biến đổi về số lượng các bản sao của gen trên nhiễm sắc thể. Gần đây, các nhà khoa học còn tăng độ phân giải của kỹ thuật lai FISH bằng cách sử dụng các sợi chất nhiễm sắc hay các microarray như một đối tượng đích. Với các công cụ trên, ngành di truyền học tế bào có thể mở rộng phạm vi nghiên cứu từ quy mô nhiễm sắc thể tới các đoạn DNA nằm trên nhiễm sắc thể.
Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn
Nguồn tham khảo:
Nature Education: "Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)"
Điểm 5/5 dựa vào 94 đánh giá
EmoticonEmoticon