A. Lý thuyết chung
1. Phát quang hóa học và phát quang sinh học
Phương pháp định lượng phát quang hóa học và phát quang sinh học là hai phương pháp được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây. Phương pháp này được dùng để xác định hàm lượng một thành phần nào đó có trong mẫu, đặc biệt là trong nghiên cứu sự biểu hiện và điều hòa hoạt động của gene. Phát quang hóa học dựa trên khả năng phát ra ánh sáng của phản ứng hóa học, trong khi phát quang sinh học cũng là một dạng phát quang hóa học nhưng ánh sáng do các enzyme khi hoạt động phát ra.
Việc đo ánh sáng phát ra từ phản ứng rất cần thiết trong việc xác định nồng độ các chất do tỷ lệ ánh sáng đi ra liên quan trực tiếp đến nồng độ các chất phát quang có trong mẫu. Do đó, khả năng phát quang được xem như dấu chuẩn để xác định nồng độ các chất có trong mẫu.
2. Thế mạnh của phương pháp
Phương pháp định lượng phát quang là kỹ thuật phân tích được sử dụng để đo lường các chất phát quang sinh học và phát quang hóa học. Phương pháp này đem lại nhiều lợi ích cho người dùng hơn so với các phương pháp khác như độ nhạy cao, dải tần nhạy sáng (dynamic range) rộng, không mất nhiều chi phí cho thiết bị, và cùng với sự phát triển của các thí nghiệm về định lượng, phương pháp này đã trở nên phổ biến và thông dụng.
Độ nhạy cao và độ chênh lệch đường nền thấp hơn so với các phương pháp phân tích khác. Định lượng phát quang có độ nhạy cao hơn 100,000 lần so với phương pháp quang phổ hấp thụ và gấp 1000 lần so với quang phổ huỳnh quang. Một thiết bị đo độ phát quang tốt có thể phát hiện ra 0,6 pg adenosine triphosphate (ATP) hay 0,1 fg enzyme luciferase, đây là hai chất phát quang phổ biến. Hình 1a và 1b cho thấy giới hạn phát hiện phản ứng ATP/luciferin-luciferase.
Phạm vi động rộng và chi phí thiết bị thấp cũng là thế mạnh của phương pháp này. Các mẫu có thể được đo với độ đặc 10x mà không cần phải pha loãng hay thay đổi lỗ đo. Hình 2 cho chúng ta thấy việc đo mẫu luciferase với độ đặc 5x khi sử dụng thiết bị định lượng phát quang Turner Design’ TD- 20/20.Trong phương pháp định lượng phát quang, có hai thông số về ánh sáng quan trọng. Đầu tiên là thông số về độ phát quang mẫu, thông số này tỷ lệ với nồng độ của chất phát quang có trong phản ứng hóa phát quang. Thông số thứ hai, được xem như đường nền và có thể biến động nhẹ do các yếu tố bên ngoài như hiện tượng lân quang của chất dẻo, hay các tạp chất trong thành phần phản ứng, ... nhưng cường độ ánh sáng đường nền của phương pháp này được đánh giá là vẫn nhỏ hơn rất nhiều so với các phương pháp khác như quang phổ hấp thụ và quang phổ huỳnh quang.
Phạm vi động rộng và chi phí thiết bị thấp cũng là thế mạnh của phương pháp này. Các mẫu có thể được đo với độ đặc 10x mà không cần phải pha loãng hay thay đổi lỗ đo. Hình 2 cho chúng ta thấy việc đo mẫu luciferase với độ đặc 5x khi sử dụng thiết bị định lượng phát quang Turner Design’ TD- 20/20.Trong phương pháp định lượng phát quang, có hai thông số về ánh sáng quan trọng. Đầu tiên là thông số về độ phát quang mẫu, thông số này tỷ lệ với nồng độ của chất phát quang có trong phản ứng hóa phát quang. Thông số thứ hai, được xem như đường nền và có thể biến động nhẹ do các yếu tố bên ngoài như hiện tượng lân quang của chất dẻo, hay các tạp chất trong thành phần phản ứng, ... nhưng cường độ ánh sáng đường nền của phương pháp này được đánh giá là vẫn nhỏ hơn rất nhiều so với các phương pháp khác như quang phổ hấp thụ và quang phổ huỳnh quang.
Một điểm cần chú ý nữa, việc sử dụng phương pháp định lượng phát quang ngày càng trở nên phổ biến trong nghiên cứu và đánh giá chất lượng. Các thành tựu của sinh học phân tử và nhu cầu ngày càng tăng của các thí nghiệm có độ nhạy cao đã mở rộng các hướng ứng dụng của hệ thống định lượng phát quang như nghiên cứu di truyền, công nghệ thực phẩm và kiểm soát môi trường.
3. Detector
Detector là một bộ phận cực kỳ quan trọng trong máy đo độ phát quang, khả năng định lượng cũng như độ nhạy của máy. Diốt quang và ống nhân quang (PMTs) là các detector phổ biến và được dùng trong các máy đo cường độ phát quang thông thường. Dòng diốt quang vẫn được cải tiến để phù hợp với nhiều mục đích sử dụng, trong khi PMTs vẫn được xem là sự lựa chọn tốt nhất khi tiến hành các thí nghiệm đo ánh sáng có cường độ thấp.
Ống nhân quang có tác dụng khuếch đại dùng photo yếu. Ống gồm photocatot, các cực trung gian và một anot (Hình 3). Dòng photo yếu đập vào photocatot làm phát xạ dòng electron, dòng electron này được các cặp điện cực khuếch đại và bắn đi với tốc độ ngày càng nhanh. Hiệu ứng này xảy ra rất nhanh và cực kỳ hữu dụng trong định lượng cường độ phát quang.
B. Một số phản ứng phát quang
1. Phản ứng phát quang hóa học
a. Phản ứng phát quang của luminol
Đây là phản ứng có thể quan sát ngay trong cuộc sống hằng ngày và đặc trưng bởi các loài động vật có khả năng phát quang. Phản ứng phát quang của luminol (5-amino-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione) được mô tả lần đầu bởi Albrecht năm 1928. Luminol sẽ phản ứng với một chất có tính oxi hóa mạnh (ví dụ như H2O2) trong môi trường alkaline, chất xúc tác của phản ứng thường là kim loại hay enzyme hay một hợp chất có chứa gốc kim loại. Phản ứng sinh ra 3-aminophthalate ở trạng thái kích thích electron và sau đó phát ra ánh sáng.
Ứng dụng phổ biến nhất của phản ứng này là xác định các chất oxi hóa hay chất tham gia phản ứng với chất oxi hóa. Ngoài ra, phản ứng này cũng dùng để xác định các ion kim loại do chúng xúc tác cho phản ứng phát quang hay là sản phẩm của enzyme xúc tác.
b. Phản ứng phát quang của Ce (IV)
Năm 1995, Zhang và các cộng sự đã đề xuất cơ chế phản ứng phát quang của Ce (IV) như sau:
Trong điều kiện có chất phát huỳnh quang, các ion Ce (III) phức hợp Ce (III)-chất phản ứng sẽ chuyển năng lượng dư thừa cho chất phát huỳnh quang và tạo ra sự phát quang hóa học:
c. Phản ứng phát quang của KMnO4
Cơ chế phản ứng phát quang của KMnO4 được Aly và đồng nghiệp đề xuất năm 1998 như sau:
Trong điều kiện có chất phát huỳnh quang, năng lượng từ phản ứng oxi hóa khử có thể được chuyển cho quinine để phát quang.
d. Phản ứng phát quang của tris (2,2’-bipyridyl)ruthenium (III)
Năm 2000, Aly và cộng sự đã công bố nghiên cứu về cơ chế phản ứng phát quang của Ru(bipy)32+ như sau:
2. Phản ứng miễn dịch enzyme phát quang (CLEIA)
Phản ứng miễn dịch enzyme phát quang (CLEIA) dựa trên sự liên kết giữa kháng thể và enzyme sử dụng các chất phát huỳnh quang và phát quang kế để định lượng. Gần đây, kỹ thuật CLEIA càng ngày càng được cải tiến, đặc biệt là về chất lượng ánh sáng đầu ra mà tiêu biểu là kỹ thuật CLEIA sử dụng các hạt từ (MPs-CLEIA), kỹ thuật này sử dụng các vi hạt từ hỗ trợ quá trình phân tách các chất và pha rắn với độ nhạy cao và khoảng phát hiện rộng. Tuy nhiên, vẫn có một nhóm nhỏ những người nghi ngờ sự vượt trội của kỹ thuật mới này so với kỹ thuật ELISA truyền thống.
Năm 2011, Zhang Quian-Yun và cộng sự đã công bố công trình so sánh hai phương pháp miễn dịch enzyme phát quang trên hạt từ và ELISA so màu cổ điển khả năng phát hiện α-fetoprotein trong huyết thanh. Về thời gian phản ứng, họ thấy rằng phương pháp MPs-CLEIA tiết kiệm tới 60 phút. Một phản ứng ELISA cần 90 phút để có kết quả, trong khi phương pháp MPs-CLEIA chỉ cần 30 phút. Nguyên nhân có thể do do các kháng thể trong phản ứng ELISA được phủ trên tấm vi thể làm giảm hiệu quả khuếch tán, trong khi phương pháp MPs-CLEIA, hỗn hợp kháng nguyên và kháng thể được trộn dưới dạng dịch đồng thể nên gia tăng khả năng bắt cặp kháng nguyên-thể. Ngoài ra, về khoảng nồng độ tuyến tính, phương pháp MPs-CLEIA có giới hạn từ 10 đến 2500 ng/ml, rộng hơn gấp 4 lần khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp ELISA. Tuy nhiên, MPs-CLEIA lại không có độ nhạy như ELISA truyền thống, độ nhạy phát hiện của MPs-CLEIA là 0,74 ng/ml, thấp hơn một chút so với ELISA (0,82 ng/ml).
Kết quả bước đầu cho thấy, phương pháp MPs-CLEIA đem lại những lợi thế cho người sử dụng sử dụng. Ví dụ như tiết kiệm hóa chất dùng cho phản ứng, hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian và có độ tuyến tính cao. Phương pháp MPs-CLEIA cũng đã được đưa vào sử dụng thực tế trong việc định lượng AFP trong máu người và thu được các kết quả rất tốt, giúp tiết kiệm chi phí, thời gian và thuận tiện trong việc phát hiện tế bào ung thư gan (HCC), giúp cho việc sàng lọc, chuẩn đoán và điều trị ung thư gan nguyên phát.
Việc định lượng chính xác thành phần thuốc rất quan trọng trong ngành dược phẩm. Tùy vào đối tượng mà có nhiều phương pháp định lượng khác nhau, chẳng hạn như khối phổ, khối phổ huỳnh quang, phát hiện điện-hóa,... Trong những năm gần đây, việc định lượng dược phẩm bằng phương pháp định lượng hóa phát quang đã dần trở nên phổ biến và đặc biệt có ý nghĩa trong thương mại do phương pháp không yêu cầu quá nhiều về thời gian phản ứng, lượng mẫu cần thiết, các hóa chất và trang thiết bị đắt tiền song vẫn đạt độ chính xác cũng như độ nhạy cao. Ba chất được sử dụng một cách phổ biến trong định lượng hóa phát quang dược phẩm là luminol, Ce(IV) và tris(2,2’-bipyridiyl)ruthenium (II).
3. Định lượng phát quang và dược phẩm
Việc định lượng chính xác thành phần thuốc rất quan trọng trong ngành dược phẩm. Tùy vào đối tượng mà có nhiều phương pháp định lượng khác nhau, chẳng hạn như khối phổ, khối phổ huỳnh quang, phát hiện điện-hóa,... Trong những năm gần đây, việc định lượng dược phẩm bằng phương pháp định lượng hóa phát quang đã dần trở nên phổ biến và đặc biệt có ý nghĩa trong thương mại do phương pháp không yêu cầu quá nhiều về thời gian phản ứng, lượng mẫu cần thiết, các hóa chất và trang thiết bị đắt tiền song vẫn đạt độ chính xác cũng như độ nhạy cao. Ba chất được sử dụng một cách phổ biến trong định lượng hóa phát quang dược phẩm là luminol, Ce(IV) và tris(2,2’-bipyridiyl)ruthenium (II).
Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn
Nguồn:
[1] A.M. Jimenez and M.J. Navas (2002): “Chemiluminescence Methods (Present and Future)”, Grasas y Aceites, Vol. 53. Fasc. 1 (2002), 64-75
[2] Qian-Yun Zhang, Hui Chen, Zhen Lin, Jin-Ming Lin (2011): “Comparison of chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic microparticles with traditional colorimetric ELISA for the detection of seruma-fetoprotein”, Journal of Pharmaceutical Analysis 2012;2(2):130–135
[3] http://www.comm-tec.com :” An Introduction to Chemiluminescence and Bioluminescence Measurements”
Điểm 4.5/5 dựa vào 75 đánh giá
EmoticonEmoticon